TSS方法制备感受态细菌

时间:12-31 09:08

TSS方法制备感受态细菌(又称一步法)一步法制备感受态细胞

一、 准备工作

1、 缓冲液1×TSS的配制一步法制备感受态细胞

事先配制1M的氯化镁――20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100ml去离子水后封装,不用灭菌。

取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯,用量筒量取100ml去离子水,加入至烧杯中,取 1 g 蛋白胨,0.5g 酵母抽提物,0.5g 氯化钠,10 g PEG(MW= 3350), 5ml DMSO,5ml 的1 M氯化镁,溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5,混匀后用0.22μm 滤器过滤除菌。储存在4度,保质期约6个月。

2、 已划平板(或者用枪头沾取并稀释后涂布)并在培养箱中过夜培养的菌种――Dh5α,用于接种并振荡培养。.两个锥形瓶,分别装有30 ml和50mlLB,灭菌后置于4℃冰箱备用。

3、 若干已灭菌的琼脂平板,一个未加抗生素,用于第二步的接种。其余做转化用。

二、 感受态制备程序:一步法制备感受态细胞

前一天晚上调单菌落至30 mlLB中过夜培养(12-16h),按1:100 比例将过夜培养的菌液(500μl)加入到新鲜的50 ml LB培养液中,于37 ℃振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h40~50min)。冰浴30分钟后4度1000g离心10min,弃上清,收获细菌。加入原体积十分之一(这里为5 ml)的1× TSS 液(冰预冷)悬浮细胞,然后分装成100 ul/份,全部冰上操作,-80度保存。

三、 转化时取一管(100μl)感受态细菌,(冻寸细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用)加入3-5μl DNA(0.1~100ng),轻轻混匀后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液,37度150r/min温和振荡培养60min,涂布,室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养(17-20h)。

TSS方法制备感受态细菌(又称一步法)一步法制备感受态细胞

一、 准备工作

1、 缓冲液1×TSS的配制:

事先配制1M的氯化镁――20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100ml去离子水后封装,不用灭菌。

取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯,用量筒量取100ml去离子水,加入至烧杯中,取 1 g 蛋白胨,0.5g 酵母抽提物,0.5g 氯化钠,10 g PEG(MW= 3350), 5ml DMSO,5ml 的1 M氯化镁,溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5,混匀后用0.22μm 滤器过滤除菌。储存在4度,保质期约6个月。

2、 已划平板(或者用枪头沾取并稀释后涂布)并在培养箱中过夜培养的菌种――Dh5α,用于接种并振荡培养。.两个锥形瓶,分别装有30 ml和50mlLB,灭菌后置于4℃冰箱备用。一步法制备感受态细胞

3、 若干已灭菌的琼脂平板,一个未加抗生素,用于第二步的接种。其余做转化用。

二、 感受态制备程序:

前一天晚上调单菌落至30 mlLB中过夜培养(12-16h),按1:100 比例将过夜培养的菌液(500μl)加入到新鲜的50 ml LB培养液中,于37 ℃振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h40~50min)。冰浴30分钟后4度1000g离心10min,弃上清,收获细菌。加入原体积十分之一(这里为5 ml)的1× TSS 液(冰预冷)悬浮细胞,然后分装成100 ul/份,全部冰上操作,-80度保存。

三、 转化时取一管(100μl)感受态细菌,(冻寸细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用)加入3-5μl DNA(0.1~100ng),轻轻混匀后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液,37度150r/min温和振荡培养60min,涂布,室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养(17-20h)。

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