mRNA差别显示技术和实验流程

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mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR(Differential Display of reverse Transcriptional PCR)简称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基应。差别基应表达(differential gene express)是细胞分化的基础。mRNA差别显示技术正是对组织特异性表达的基应进行分离的一种快速而行之有效的方法。该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品,经总RNA提取后,进行mRNA反转录合成cDNA。此cDNA的合成是采用Oligo(dT)12 MN为引物,其中M为A,C,G中的任意一种,N为A,C,G或T中的任意一种,所以共有12种oligo(dT)12 MN引物,其中M称为锚定碱基,起增大引物Tm值的作用,N称为分类碱基,对反转录进行分类。用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成,即进行12次不同的反转录反应,从而使反转录的cDNA具有12种类型,也就是对cDNA进行12种归类(目前较为流行的方法是进行4种归类,即M为简并碱基的形式存在),在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增,通过对组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物凝胶电泳分析,从而反映出不同样品间基应的时间和空间上组织特异性的表达。如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多,很难用电泳系统加以快速准确地分离。应而需要对反转录产物cDNA进行归类处理,减轻不同PCR产物电泳分离的难度,提高分离的准确率。(见示意图)
 
一、实验流程:
 
对照组的总RNA提取
mRNA完整性鉴定
 
实验组的总RNA提取
mRNA完整性鉴定
                        
锚定引物逆转录成cDNA
 
锚定引物逆转录成cDNA
                       
采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增
 
采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增
            
扩增产物进行凝胶电泳分析
ß
差异性条带的回收与第二次扩增
ß
Northern杂交,Southern杂交再次确定差异性条带的真实性
ß
差异性条带的克隆、测序、分析,DNA及氨基酸序列联机检索
ß
以差异性条带为探针克隆出基应组文库中的基应
序列及cDNA文库中的全长cDNA序列
ß
基应功能的鉴定:
        knock out
        dominant negative mutation
③原核系统或真核系统中的表达翻译。抗体的制
          备,细胞内的定位,抗体抑活等等。
        one hybrid判断出该基应的“启动”基应。
two hybrid判断出该基应的产物的作用途径。
这里以CLONTECH公司生产的DeltaTM Differential Display Kit为例,介绍具体的实验步骤。该试剂盒中含有10种任意引物和9种Oligo(dT)引物。
 
二、             操作步骤
 
1.总RNA的提取(见Northern 杂交)
2.第一链合成:
(1)总RNA样品 2μg;cDNA合成引物 1μl;加ddH2O补至5μl。将管标号为1A,2A,PC A等。PC为阳性对照。
(2)混匀后稍离心。
(3)70℃孵育3min,冰浴2min后稍离心。
(4)准备dNTP mix (以5管为例 )
                                每管             5
   5×第一链缓冲液              2μl             10μl
   dNTPmix(各5mM)            2μl             10μl
   MMLV逆转录酶(200u/μl)   1μl              5μl
                                5μl             25μl
(5)每管加入5μl,混匀后稍离心。
(6)42℃孵育1hr。
(7)75℃ 10min终止反应后置冰上,稍离心。
(8)将2μl反应液分别转至新管中(新管标号为1B,2B,PC B等)。
(9) 将78μl ddH2O分别加入B管中,混匀。
(10)将72μl ddH2O分别加入A管中,混匀。
(11)将所有cDNA稀释液 -20℃保存待用。
3.dd-PCR: 以 引物P1,T9为例说明
            0.5ml PCR管,1代表对照组,2代表实验组)
     管号             cDNA样品                引物
     (1)                1A                    P1,T9
     (2)                1B                    P1,T9
     (3)               2A                    P1,T9
     (4)                2B                    P1,T9
     (5)                H2O                   P1,T9
     (6)                RNA1                  P1,T9
     (7)                RNA2                  P1,T9
     以下为阳性对照反应体系
     (8)               PC 1A                   P10,T8
     (9)               PC 1B                   P10,T8
     (10)              PC 2A                   P10,T8
     (11)              PC 2B                   P10,T8
     (12)             H2O                      P10,T8
     (13)              PC RNA1                 P10,T8
     (14)              PC RNA2                 P10,T8
PCR 管中加入:
cDNA样品                1μl
      P引物                1μl
      T 引物                1μl
② 准备其它 PCR试剂的混合液: (在另一管中加入)
   成分         每管(μl)       所需管数( n=14)
 10×buffer       2.0                2n
   ddH2O         14.0               14n
 dNTPmix          0.2             0.2n
 α-32P dATP       0.4             0.4n
 Taq            0.4             0.4n
 终体积          17.0             17 n
 混匀后稍离心。
③ 将17μlPCR混合液加入各反应管,则各管总体积为20μl。
④ 开始PCR扩增。
PCR循环参数:
   GeneAmp PCR Systems 2400 & 9600 扩增仪上执行以下程序:
 
                             94 5min
                1 cycles     405min
                              685min
 
                            94 30sec
                2 cycles       40 30sec
                               685min
 
                            9420sec
               23 cycles       40 30sec
                               68 2min
                               
                1 cycles       687 min。
⑥ 反应结束后置-20℃保存备用。
4.电泳和放射自显影
(1)配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶,灌注测序板。
(2)预电泳30min。
(3)每个dd-PCR反应取出5μl于一新微量离心管中,加5μl loading
  buffer,混匀,离心,置94℃变性2min。立即置冰浴。
(4)停止预电泳,冲洗加样孔。
(5)加样2μl。70W电泳2.75hr至二甲苯青到达胶的底部。
(6)下胶:(同测序胶)
(7)干胶:在胶表面覆上保鲜膜,80℃干胶30min。
(8)X光片-70℃曝光过夜或更长时间(根据射线强度而定)。
2-6显示了dd-PCR放射自显影的X光片
5.差异条带回收再扩增
(1)X光片经D72显影、酸性定影液定影后,水洗晾干。置X光片灯上比较寻找差异条带。
(1) 用一次性手术刀片在胶上切割差异条带,加ddH2O 20μl,沸水浴15min,离心取上清为模板。
(3) 以原引物扩增:
          回收DNA               7   μl
          10×PCR buffer         5   μl
          5mM dNTPmix            0.5 μl           
          引物P                 2.5 μl
          引物T                 2.5 μl
          Taq酶                 2   μl
        ddH2O至总体积为50μl
(4) 执行PCR程序:
   933min;93℃1min→60℃1min→68℃2min,20次循环;68℃5min。
(5) PCR产物10μl 2%琼脂糖电泳检测。
(6) PCR产物乙醇沉淀,10μlddH2O溶解。
6.以PCR产物为探针,标记后进行Northern杂交,证实基应的真实性。
7.PCR产物的TA克隆。
8.DNA序列测定。
9.检索分析。

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