氯胺T法标记蛋白质试验方法

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 生物试验技术:1)放射性碘源的选用:无载体的131I或125I均可用于碘化标记,但应尽量选用新鲜的、比放射强度高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比放射强度最好≥50~100mCi/ml,至少也要>30mCi/ml,否则加入碘源的容量要增加,随着带入碘源中含有的还原剂(为放射性碘源运输保存所需加入)量也增加,这将会显著降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。放置较久和放射性碘源,一方面因衰变致比放射强度降低,另一方面因水的辐射化学产物增多(主要是131I源),都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂(如Na2S2O5等)量多时,会抵消氯胺T的作用,降低碘利用率,甚至导致标记完全失败。放射性碘源要用无载体的,标记所用全部用具和试剂必须不含碘;只要有极少量的碘的污染,非放射性碘就会稀释放射性碘,使放射性碘利用率显著降低。为了便于放射性防护和除污染,以及减少射线对蛋白质分子的损伤,标记投入的放射碘量不宜过大,一般以<5mCi为宜。

  生物试验技术:(2)放射性碘与多肽、蛋白质用量的比例:这比例对标记结果的影响很大。如上述原因,一般标记时放射性投入量不宜过多,示踪实验室中常规每次只用1~2mCi,因而放射性碘与多肽、蛋白质用量的比值主要靠标记时投入的多肽、蛋白质用量来控制。当投入的放射碘量一定时,多肽、蛋白质用量多(即I/多肽、蛋白质比值低),能获得高碘利用率,但所得标记蛋白比放射强度低;相反多肽、蛋白质用量少(即I/多肽、蛋白质比值高),则碘利用率降低,但所得标记多肽、蛋白比放射性随此比值变化都有较大的变动;而当此比值<1后,则碘利用率再下降的幅率较小,标记多肽、蛋白比放射性也不会再增加多少。

  生物试验技术:(3)氯胺T与偏重亚硫酸钠的用量及碘化反应时间:氧化碘化标记法中,会导致失活的最主要原因是氧化还原。氯胺T是氧化剂,早期用氯胺T法作碘化标记时氯胺T用量都比较大,或碘化反应时间较长,结果导致蛋白质结构和活性的严重损伤。氯胺T用量大,或长时间进行碘化反应,结果并不能使碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度提高多少,反而使标记多肽、蛋白活性下降。当用不含还原剂或还原剂很少的放射性碘源时,试以各种蛋白质(包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰岛素等)作微量标记,当氯胺T用量为20μg/0.1ml反应液、0~20C反应20s,碘利用率都已接近或达到最大峰,再加大氯胺T用量和延长反应时间是没有必要的。随放射性碘源中还原剂增多,氯胺T用量也应增加,以达到预期的碘利用率,但决不应盲目加大氯胺T用量和延长碘化反应时间(通常反应时间不要超过1min),否则会导致标记多肽、蛋白质严重失活,不能用于实验。当然,减少氯胺T用量要在了解放射性碘源还原剂含量的基础上,否则碘源中还原剂量较多,双盲目减少氯胺T用量,就会使标记失败。一般用125I标记时,氯胺T用量要适当加大。加入氯胺T后必须迅速混匀,以防标记不均匀。氯胺T与偏重亚硫酸钠溶液要新配制的。

  氯胺T用量减少了,Na2S2O5用量也就可以随之减少。为保证按时终止碘化反应,实验时加入Na2S2O5一般都是过量的。氯胺T用量大时,加入Na2S2O5的剩余量也就会随之增加,这就可能加重某些对还原剂敏感的蛋白质或多肽生物活性的损伤。为此,Na2S2O5用量也不应过多。只要药品没有变质、试剂是新配的,以重量计算Na2S2O5加入量与氯胺T相同就足以保证终止碘化反应(按反应克分子浓度计算,Na2S2O5/氯胺T重量比约0.4),不要盲目加大用量,并应迅速将标记多肽、蛋白质从反应液中分离出来,以尽量减少多肽、蛋白质活性的损伤。

  某些蛋白质或多肽对氯胺T较敏感,还可进一步减少氯胺T用量、缩短碘化反应时间、降低反应温度,以保护蛋白质的活性。这对一些较容易丧失活性蛋白质或多肽的碘标记十分重要。

  生物试验技术:(4)碘化反应体积:系指加入Na2S2O5终止反应前液体的总量。碘化反应体积愈小,局部反应物浓度愈高,所得碘利用率和标记多肽、蛋白比放射强度就愈高。所以,标记应采用比放射标记效果。当反应液量少(<0.2~0.3ml)时,反应体积对碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度的高低影响较大;当反应液量大(>0.5~1.0ml)时则影响较小。微量氯胺T法放射碘标记时,一般多控制碘化反应体积<100μl。

  生物试验技术:(5)碘化反应温度:温度升高,碘化反应速度加快,碘利用率有所增加。但总的来看,反应温度的影响不很大,一般从0到20℃碘利用率相差不过百分之几,故一般在室温下进行标记操作就可能获得重复性好的结果。有些蛋白质或肽类极易丧失活性,则可在0℃进行碘化反应。

  生物试验技术:(6)碘化反应的pH值:受氧化剂氧化生成的活性碘,对多肽链的酪氨酸基苯环羟基邻位的碘化作用,最适pH是7.3~7.8之间。当pH变化时,碘化位置也会发生变化,例如pH值较高时,组氧酸的咪唑环也可被碘化;当pH4~5时,活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羟基吲哚,导致肽链断裂。这些都会影响蛋白质或多肽的放射性碘化反应,或引起降解或失活。因此作放射性碘化标记时,除放射性碘源外,所有的试剂都应用适当的缓冲液配制,保证碘化反应在最佳pH条件下进行。

  生物试验技术:(7)微量蛋白质或多肽的吸附损失:界面的吸附损失,在使用大量蛋白质或多肽类时是可以忽略的,但作微量法标记时投入的蛋白质或多肽类只在微克甚至毫克甚至毫微克水平,界面吸附导致的损失就不能忽略。例如制备131I—ACTH时,所用ACTH浓度低到50Pg/ml时,因表面吸附可损失10%~30%,甚至高达75%。改变pH、加入非特异性载体蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器时,能减少吸附,但不能完全消除。一般残留在反应管和滴管上的放射性为投入总放射性的2%~8%、残留在层析柱上折占5%~10%。残留量随标记蛋白比放射性强度而直线增减,残留者几乎全部都是标记蛋白。由此可见,微量蛋白质或多肽受吸附而损失的量是不容忽略的。由于微量蛋白质、多肽会被显著吸附而丢失,所以标记时投入蛋白质、多肽量过微(如<2μg)也是不适宜的,否则标记蛋白质、多肽的收回率会太低,并在计算上会造成较大的误差。

  生物试验技术:(8)不同蛋白质、多肽碘化标记的差别:由于不同的蛋白质和多肽分子中含有的酪氨酸数目不同,而且其空间结构也不相同,分子中的酪按酸残基有的容易发生碘化反应,有的就不容易碘化,因此同样条件下进行碘化标记,不同蛋白质或多肽对碘的利用率是不相同的。不同蛋白质经碘化标记后生物活性受损的情况也各不相同。例如ACTH、促性腺激素释放激素(GRH)、促黄体激素释放激素(LRH)等多肽,碘化标记后容易丧失激素活性或与受体结合的活性;而AFP及人绒毛膜促性腺激素(HCG)等的碘化标记,则较容易保存良好的免疫化学活性。

  尽管不同多肽、蛋白度的碘化标记结果有所差别,但上述讨论的因素对不同多肽、蛋白质碘化标记的影响有共同的规律。掌握了这些因素,就容易成功地获得合格的标记物。

  不同多肽、蛋白质的分子量大小、理化性质各不相同,放射碘化标记反应后,可根据具体情况采取不同的方法将标记蛋白质(或多肽)与未反应的游离放射性碘及受损伤的标记物分开,常用的方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、各种电泳法等。

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