双缩脲法(Biuret法)

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(一)實驗原理

雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩 個分子脲經180℃左右加熱,放出一個分子氨後得到的産物。在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物,稱爲雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵,或能過一個中間碳原子相連的肽鍵,这類化合物都有雙縮脲反應。

紫色絡合物顔色的深浅與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。測定範圍爲1~10mg蛋白質。幹擾这一測定的物質主要有:硫酸铵、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優點是較快速 ,不同的蛋白質産生顔色的深浅相近,以及幹擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速,但並不需要十分精確的蛋白質測定。

(二)試劑與器材

1. 試劑:

(1)標准蛋白質溶液:用標准的結晶牛血清清蛋白(BSA)或標准酪蛋白,配制成10mg/ml的標准蛋白溶液,可用BSA濃度1mg/ml的A280爲0.66來校正其純度。如有需要,標准蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,計算出其純度,再根據其純度,稱量配制成標准蛋白質溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05N NaOH配制。

(2)雙縮脲試劑:稱以1.50克硫酸銅(CuSO4--5H2O)和6.0克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6--4H2O),用500毫升水溶解,在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀釋到1升,貯存于塑料瓶中(或內壁塗以石蠟的瓶中)。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沈澱出現,則需要重新配制。

2. 器材:

可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。

(叁)操作方法

1. 標准曲線的測定:取12支試管分兩組,分別加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的標准蛋白質溶液,用水補足到1毫升,然後加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻後,在室溫(20~25℃)下放置30分鍾,于540nm處進行比色測定。用未加蛋白質溶液的第一支試管作爲空白對照液。取兩組測定的平均值,以蛋白質的含量爲橫座標,光吸收值爲縱座標繪制標准曲線。

2、樣品的測定:取2~3個試管,用上述同樣的方法,測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。

叁、Folin--酚試劑法(Lowry法)

(一)實驗原理

这種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法,由于其試劑乙的配制較爲困難(現在已可以訂購),近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入暸第二種試劑,即Folin--酚試劑,以增加顯色量,從而提高暸檢測蛋白質的靈敏度。这兩種顯色反應産生深蘭色的原因是:在堿性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成複合物。 Folin--酚試劑中的磷钼酸鹽--磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,産生深蘭色(钼蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。

Folin--酚試劑法最早由Lowry確定暸蛋白質濃度測定的基本步驟。以後在生物化學領域得到廣泛的應用。这個測定法的優點是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多,缺點是費時間較長,要精確控制操作時間,標准曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,幹擾物質較多。對雙縮脲反應發生幹擾的離子,同樣容易幹擾Lowry反應。而且對後者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸铵、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有幹擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),硝酸納(1%),叁氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響,但这些物質濃度高時,必須作校正曲線。含硫酸铵的溶液,只須加濃碳酸鈉--氫氧化鈉溶液,即可顯色測定。若樣品酸度較高,顯色後會色浅,則必須提高碳酸鈉--氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。

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