细胞早期凋亡检测方法

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1 PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測

PS從細胞膜內側轉移到外側在細胞受到凋亡誘導後不久發生, 可能作爲免疫系統的識別標志。AnnexinV,一個鈣依賴性的磷脂結合蛋白,能專一性的結合暴露在膜外側的PS,再通過簡單的顯色或發光系統進行檢測。由于这是一種凋亡早期的活細胞檢測(懸浮細胞和貼壁細胞都適用),可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發展階段。

美國著名生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開發暸多種標記的Annexin V産品,簡便快速,10分鍾就可完成檢測。其中帶熒光標記的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC,靈敏度高,可作爲FACS(流式細胞分選)方法篩選凋亡細胞的基礎。由于融合蛋白Annexin V-EGFP,EGFP與PS 的結合比例爲1:1,還可進行定量檢測。除此之外,還提供生物素偶聯的Annexin V,可通過常用的酶聯顯色反應來檢測。另外,MACS公司將磁珠包被Annexin V,可采用磁分選方法篩選凋亡細胞。

2 細胞內氧化還原狀態改變的檢測

这反應暸細胞凋亡研究中相對較新的趨勢,研究什麽樣的氧化還原環境引起下遊事件的發生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過熒光染料monochlorobimane(MCB)體外檢測凋亡細胞細胞質中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細胞內氧化還原狀態的變化。正常狀態下,谷光苷肽(glutathione:GSH)作爲細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。这一反應在線粒體中尤爲重要,許多呼吸作用中副産物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細胞中,細胞膜中有可被凋亡信號啓動的ATP依賴的GSH轉移系統。當細胞內GSH的排除非常活躍時,細胞液就由還原環境轉爲氧化環境,这可能導致暸凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低,從而使細胞色素C(叁羧酸循環中的重要組分)從線粒體內轉移到細胞液中,啓動凋亡效應器caspase的級聯反應。

由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關,此項檢測除暸對研究細胞凋亡的起始非常有用外,還可用于心髒病、中風等疾病治療的研究。但有些細胞如:HeLa 和3T3細胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化,不能用此法檢測。

3 細胞色素C的定位檢測

細胞色素C作爲一種信號物質,在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下,它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中,凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液,結合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)後啓動caspase級聯反應:細胞色素C/Apaf-1複合物激活caspase-9,後者再激活caspase-3和其它下遊caspase。細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ:COX4)是定位在線粒體內膜上的膜蛋白,凋亡發生時,它保留在線粒體內,因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標志。

ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心,可從凋亡和非凋亡細胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分,再進一步通過Western雜交用細胞色素C抗體和COX4抗體標示細胞色素C和COX4的存在位置,從而判斷凋亡的發生。

4 線粒體膜電位變化的檢測

在凋亡研究的早期,從形態學觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機制研究的深入,發現線粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分,發生很多生理生化變化。例如,在受到凋亡誘導後線粒體轉膜電位會發生變化,導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM,一個陽離子性的染色劑,對此改變非常敏感,呈現出不同的熒光染色。正常細胞中,它在線粒體中形成聚集體,發出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中,因線粒體穿膜電位的改變,它以單體形式存在于細胞液中,發出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨这兩種不同的熒光信號。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是,这種方法不能區分細胞凋亡或其他原因導致的線粒體膜電位的變化。

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