细胞晚期凋亡检测方法

时间:02-08 04:27

細胞凋亡晚期中,核酸內切酶(某些Caspase的底物)在核小體之間剪切核DNA,産生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。對于这一現象的檢測通常有以下幾種方法:

1 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)

通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP (多爲dUTP)間接(通過地高辛)或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果。美國Intergen公司提供多種標記方法,直接熒光標記,地高辛介導熒光標記或過氧化物酶聯顯色,可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。其中,直接標記步驟少,操作簡便。而間接標記有信號放大的作用,檢測靈敏度高。

2 LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)

當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少(如活體組織切片)時,直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR(ligation-mediated PCR),連上特異性接頭,專一性地擴增核小體的梯度片段,從而靈敏地檢測凋亡時産生的核小體的梯度片段。此外,LM-PCR 檢測是半定量的,因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。

上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂这一特征,但細胞受到其它損傷(如機械損傷,紫外線等)也會産生这一現象,因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的幹擾。

3 Telemerase Detection (端粒酶檢測)

这是相對來說推出較早,用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白,它可以自身RNA爲模板逆轉錄合成端粒區重複序列,使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的,每分裂一次,染色體的端粒會縮短,这可能作爲有絲分裂的一種時鍾,表明細胞年齡、複制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現,90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物,分別與底物及端粒重複序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性,就能在底物上接上不同個數的6堿基(GGTTAG)端粒重複序列,通過PCR反應,産物電泳檢測就可觀察到相差六個堿基的DNA Ladder現象。此外,Intergen公司還提供用酶聯免疫法(ELISA)檢測的試劑盒.

同樣,这種檢測方法也不專對細胞凋亡,檢測結果也不純反應細胞凋亡的發生。

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