细胞分离方法

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一、離心技術

離心是研究如細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體,以及各種大分子基本手段。一般認爲,轉速爲10~25Kr/min的離心機稱爲高速離心機;轉速超過25Kr/min,離心力大于89Kg者稱爲超速離心機。目前超速離心機的最高轉速可達100Kr/min,離心力超過500Kg。

(一)、差速離心(differential centrifugation)

在密度均一的介質中由低速到高速逐級離心,用于分離不同大小的細胞和細胞器。

在差速離心中細胞器沈降的順序依次爲:核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內質網與高基體、最後爲核蛋白體。

由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊,而且某些慢沈降顆粒常常被快沈降顆粒裹到沈澱塊中,一般重複2~3次效果會好一些。

差速離心只用于分離大小懸殊的細胞,更多用于分離細胞器。通過差速離心可將細胞器初步分離,常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。

(二)、密度梯度離心(density gradient centrifugation)

用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度,將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部,通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。这類分離又可分爲速度沈降和等密度沈降平衡兩種(圖2-23)。密度梯度離心常用的介質爲氯化色,蔗糖和多聚蔗糖。分離活細胞的介質要求:1)能産生密度梯度,且密度高時,粘度不高;2)PH中性或易調爲中性;3)濃度大時滲透壓不大;4)對細胞無毒。

1、速度沈降

速度沈降(velocity sedimentation)主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。这種降方法所采用的介質密度較低,介質的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。

生物顆粒(細胞或細器)在十分平緩的密度梯度介質中按各自的沈降系數以不同的速度沈降而達到分離。

2、等密度沈降

等密度沈降(isopycnic sedimentation)適用于分離密度不等的顆粒。

細胞或細胞器在連續梯度的介質中經足夠大離心力和是夠長時間則沈降或漂浮到與自身密度相等的介質處,並停留在那裏達到平衡,從而將不同密度的細胞或細胞器分離。

等密度沈降通常在較高密度的介質中進行。介質的最高密度應大于被分離組分的最大密度,而且介質的梯度要求較高的陡度,不能太平緩。再者,这種方法所需要的力場通常比速率沈降法大10~100倍,故往往需要高速或超速離心,離心時間也較長。大的離心力、長的離心時間都對細胞不利。大細胞比小細胞更易受高離心力的損傷,而且停留在等密度介質中的細胞比處在移動中的細胞受到更大的損傷。因此,这種方法適于分離細胞器,而不太適于分離和純化細胞。

二、流式細胞術

流式細胞術是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。在分析或分選過程中,包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴,形成包含單個細胞的液滴,在激光束的照射下,这些細胞發出散射光和熒光,經探測器檢測,轉換爲電信號,送入計算機處理,輸出統計結果,並可根據这些性質分選出高純度的細胞亞群,分離純度可達99%。包被細胞的液流稱爲鞘液,所用儀器稱爲流式細胞計(flow cytometer)。

叁、細胞電泳

在一定PH值下細胞表面帶有淨的正或負電荷,能在外加電場的作用下發生泳動,这種現象稱爲細胞電泳(cell electrophoresis)。引起細胞電泳的電位值稱爲ξ電位。各種細胞或處于不同生理狀態的同種細胞荷電量有所不同,故在一定的電場中的泳動速度不同。在恒定的電場條件下,同種細胞的電泳速度相當穩定,因而可通過測定電泳速度來推算出細胞的ξ電位。ξ電位常因細胞生理狀態和病理狀態而異,因此在诊斷疾病上有一定價值。此外由于不同類型的細胞在電場中的泳動速度不同,細胞電泳尚可用來分離不同種類的細胞,例如可把淋巴樣細胞與造血細胞分開。

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