高效液相色谱柱的选择

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.Zbq522 一、矽膠基質填料

1、正相色譜 正相色譜用的固定相通常爲矽膠(Silica)以及其他具有極性官能團胺基團,如(NH2,APS)和氰基團(CN,CPS)的鍵合相填料。

由于矽膠表面的矽羟基(SiOH)或其他極性基團極性較強,因此,分離的次序是依據樣品中各組分的極性大小,即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低,如正已烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等。

2、反嚮色譜 反嚮色譜用的填料常是以矽膠爲基質,表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反嚮色譜所使用的流動相極性較強,通常爲水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分最先被沖洗出,而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。

常用的反嚮填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。

二、聚合物填料 聚合物填料多爲聚苯乙烯--二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等,其重要優點是在PH值爲1--14均可使用。相對于矽膠基質的C18填料,这類填料具有更強的疏水性;大孔的聚合物對蛋白質等樣品的分離非常有效。現有的聚合物填料的缺點是相對矽膠基質填料,色譜柱柱效較低。

叁、其它無機填料 其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化由于其特殊的性質,一般僅限于特殊的用途。如,石墨化碳黑正逐漸成爲反嚮色譜柱填料。这種填料的分離不同于矽膠基質烷基鍵合相,石墨化碳的表面即是保留的基礎,不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相矽膠或多孔聚合物填料的保留能力更強。石墨化碳可用于分離某些幾何異構體,由于在HPLC流動相中不會被溶解,这類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強,可制成穩定的色譜柱柱床,其優點是可以在PH高達12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強,應用範圍受到一定限制,所以未能廣泛應用。新型色譜氧化锆基質填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物塗層的多孔氧化锆微球色譜柱,應用PH1-14,溫度可達100℃。由于氧化锆填料是最近幾年才開始研究,加之面臨的實驗難度,其重要用途與優勢尚在進行之中。

怎樣選擇填料粒度 目前,商品化的色譜填料粒度從1um到超過30um均有銷售,而目前分析分離主要用3和5um填料進行。填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數,即柱效和背壓。粒度越小,柱壓越大,柱壓的增加限制暸粒度小于3um的填料應用。在相同選擇性條件下,提高柱效可提高分離度,但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那麽選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時,柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱,即相同的塔板數或分離能力,但是柱長更短,以縮短分析時間。另外,可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色譜柱的壓力。

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