物理图

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物理圖是指標明一些界標(例如限制酶的切點、基因等)在DNA上的位置,圖距以物理長度爲單位,例如染色體的帶區、核苷酸對數目等。人類基因組計劃的研究目標是,構建人的每條染色體的STS圖,標記之間相距約10Okb。獲得一組組DNA片段的克隆,組內兩兩片段之間有共同的重疊序列;或是獲得標記按正確次序排列、相互毗鄰的片段,其連續長度超過2000kb,以便把染色體分段進行研究。

最通常的物理圖的構建方法是把限制酶切的DNA片段,按其次序排列連接起來。作圖的技術路線基本上分兩類:一類是由長到短作圖,另一類則是由短到長作圖。前者是將基因組DNA用切點很少的限制酶如NotI等完全酶切,得到長約100~l000kb的DNA長(大)片段,每條染色體平均切成130個片段,按照片段上的標記把片段按次序排列,然後再把每一長片段酶切成短片段,再把短片段排列成序。这是由長到短的作圖,圖比較完整但分辨率低。後一類方法則是先將基因組DNA用限制酶作部分酶切,得到的短片段分別用酵母人工染色體(YAC)或粘粒等作載體加以克隆,然後根據克隆片段兩端共有的序列即重疊序列,兩兩連接,逐漸延伸成長片段。这樣作圖分辨率較高,但圖不完整往往留有空缺。这是因爲有些酶切産生的DNA片段太短,不易被克隆,以致在通過重疊序列把片段連接時出現中斷。一組相互鄰接的DNA片段的克隆稱爲鄰接DNA片段組(contig)。目前一個contig通常只有2~6個粘粒克隆,即所含的DNA片段相加只有100~300kb,如除去兩兩片段的重疊序列,則一個contig作圖覆蓋的DNA長度是有限的。現在要求在5年內做到一個contig能覆蓋2000kb DNA,並帶有幾個標記。

在制作物理圖時,重點發展的幾種實驗技術是:(1)脈沖電場凝膠電泳,这是分離高分子量DNA的一種電泳技術,使DNA分子處在兩個相互垂直、交替更換的電場中移動,把分子量不同的DNA片段分開,可分辨50kb至200kb的DNA分子。(2)YAC克隆:YAC是由質粒pBR322、酵母的著絲粒、四膜蟲rDNA的端粒、酵母的自主複制序列(ARS)以及一些選擇標記基因構成。呈環狀結構時,可以質粒方式在原核細胞中增殖複制。切成線狀結構後,可連同插入的外源DNA,如染色體一樣地在酵母細胞中複制、分配給子細胞。YAC作爲載體,克隆的外源DNA平均300kb,最長的可達100Okb,穩定地傳遞給子細胞。設計構建YAC時,在原核生物的複制起點〔Ori)上遊安排一個限制酶切位點(如XhoI),當YAC載 有外源DNA後,只需用Xhol酶切,則靠近克隆位點的外源DNA上的XhoI切點,可與YAC的XhoI切點互補結合呈環狀,按質粒進行複制和被回收。这種技術稱爲質粒獲救。用这種方法可把外源DNA的末端分離出來,作爲釣取與其鄰接的、具有共同末端序列亦即重疊序列的另一DNA片段的探針。實際上这也就是染色體步移的操作。(3)PCR(多聚酶鏈反應):體外擴增DNA的技術,在生物學、醫學等基礎研究和臨床诊斷上有極其廣泛的用途。在構建基因組物理圖時,主要用于驗證STS。(4)熒光原位雜交:傳統的以同位素標記探針作原位雜交,曝光後的顆粒較粗,定位不易精確。正在研究以熒光染料代替同位素,提高定位的精確度。(5)輻射雜種細胞分析,这是利用體細胞遺傳學的方法構建高分辨的染色體圖的技術。人-鼠雜種細胞接受射線輻照後,染色體斷裂,篩選出保留缺失程度不同的人染色體的雜種細胞,可用于構建大尺度染色體物理圖。

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